细胞活力测定是评估细胞生理状态、药物毒性、环境因素影响的核心实验技术，广泛应用于基础研究、药物筛选及临床前评价。其核心是通过检测细胞的代谢活性、细胞膜完整性或增殖能力，量化活细胞比例或数量。
一、实验原理细胞活力的本质是细胞维持正常代谢、增殖及结构完整的能力。活力测定基于活细胞特有的生物学特性设计：代谢活性(如线粒体酶催化反应、ATP 合成)、细胞膜功能(如物质主动运输、屏障作用)、增殖能力(如 DNA 合成)。当细胞受损或凋亡时，这些功能会出现特征性改变，例如线粒体脱氢酶活性下降、细胞膜通透性增加、ATP 水平降低等。实验通过特异性检测这些指标，间接反映活细胞数量或活力百分比。
二、常用测定方法(一)基于代谢活性的检测
1. MTT 法
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将黄色四唑盐(MTT)还原为蓝紫色甲瓒结晶，结晶量与活细胞数成正比。经 DMSO 溶解后，通过酶标仪检测 570nm 处吸光度(OD 值)定量。该方法成本低、操作简单，但灵敏度较低，且不适用于悬浮细胞(结晶易被冲走)。
展开剩余80%2. CCK-8 法
利用细胞内脱氢酶将水溶性 WST-8 转化为橙黄色甲瓒，生成量与活细胞数正相关。无需裂解细胞，可直接检测 450nm OD 值，灵敏度高于 MTT，且适用于长期动态监测。但试剂成本较高，受血清成分影响较大。
3. ATP 检测法
活细胞内 ATP 含量稳定，死亡细胞因 ATP 酶降解作用快速失去 ATP。通过荧光素 - 荧光素酶反应检测 ATP 发光强度，可精准量化活细胞数量，灵敏度极高(可检测单个细胞)，适合高通量筛选。但需专用发光检测仪，且试剂易受污染失效。
(二)基于细胞膜完整性的检测
1. 台盼蓝染色法
台盼蓝是一种阴离子染料，无法穿透活细胞完整的细胞膜，但可进入死亡细胞并使其染成蓝色。通过显微镜计数活细胞(无色)与死细胞(蓝色)比例，快速评估细胞活力。该方法操作简便、成本极低，但主观性强，仅适用于粗略估算。
2. LDH 释放法
乳酸脱氢酶(LDH)存在于活细胞胞质中，当细胞膜受损时释放到培养液中。通过检测培养液中 LDH 活性(催化丙酮酸生成乳酸的反应)，间接反映细胞死亡比例。特异性高，适合评估药物或毒素引起的急性细胞损伤。
(三)基于增殖能力的检测
1. BrdU 掺入法
BrdU 是胸腺嘧啶类似物，可在细胞增殖时掺入新合成的 DNA 中。通过抗 BrdU 抗体检测掺入量，反映细胞增殖活性(与活细胞数量正相关)。适用于长期活力监测，但需 DNA 变性步骤，可能影响细胞形态。
2. 克隆形成实验
将细胞稀释后接种于培养皿，培养 1-2 周后计数形成的克隆(>50 个细胞)数量，计算克隆形成率。可直观反映细胞的长期增殖能力和自我更新能力，适合评估干细胞或肿瘤细胞活力，但实验周期长。
三、实验操作步骤(以 CCK-8 法为例)
细胞接种：取对数生长期细胞，用胰酶消化后制成单细胞悬液，调整浓度至 1×10⁴-1×10⁵个 /mL，接种于 96 孔板(每孔 100μL)，每组设 3-6 个复孔，同时设置空白对照组(仅培养基)。
处理与培养：根据实验目的加入药物、毒素或其他处理因素，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养(时间根据处理因素调整，如药物毒性实验可设 24h、48h、72h 三个时间点)。
显色反应：每孔加入 10μL CCK-8 试剂，轻轻振荡混匀，避光孵育 1-4h(具体时间需预实验确定，以 OD 值在 0.5-2.0 之间为宜)。
检测与计算：用酶标仪测定 450nm 处 OD 值，按公式计算细胞活力：
细胞活力(%)=(实验组 OD 值 - 空白组 OD 值)/(对照组 OD 值 - 空白组 OD 值)×100%
四、注意事项细胞状态控制：确保接种细胞均匀、活力 > 90%，避免因细胞聚团或凋亡影响结果;悬浮细胞需在接种后立即离心(1000rpm，5min)使细胞贴壁均匀。
试剂使用规范：CCK-8、MTT 等试剂需避光保存，使用前平衡至室温;台盼蓝染液需新鲜配制，过滤去除杂质，避免假阳性染色。
实验条件优化：根据细胞类型调整接种密度(如肿瘤细胞密度可稍高，原代细胞密度需偏低);显色时间需通过预实验确定，避免过短(信号弱)或过长(底物耗尽)。
干扰因素排除：含酚红的培养基可能影响吸光度检测，需用空白组校正;某些药物(如抗氧化剂)可能抑制脱氢酶活性，导致结果偏低，需结合其他方法验证。
数据可靠性保障：复孔数量不少于 3 个，实验重复 3 次以上;使用 GraphPad Prism 等软件进行统计学分析，采用均值 ± 标准差表示结果，通过 t 检验或方差分析判断差异显著性。
选择合适的细胞活力测定方法需结合实验目的、细胞类型及实验室条件：快速初筛可选用台盼蓝或 MTT 法，精准量化推荐 ATP 检测或 CCK-8 法，长期监测优先考虑 BrdU 掺入或克隆形成实验。通过严格控制实验变量，可确保结果的准确性与重复性，为细胞生物学研究提供可靠依据。
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